在《蜘蛛侠3》中，玩家将扮演蜘蛛侠这位同名英雄，与新妖精、沙人和毒液三位超级反派战斗，守护纽约市的安全。这款游戏改编自2007年上映的同名电影。

游戏玩法与《蜘蛛侠2》颇为相似，玩家可以以“沙盒”模式自由探索纽约大都会的大型模型。然而，这一次的城市规模更大，除了城市的其他部分，玩家还可以探索地铁和污水处理系统。此外，玩家还可以探索第三部电影中未涉及的替代故事。这些替代故事情节可能包括与蜘蛛侠系列中著名的反派（例如克莱文、蜥蜴人、蝎子、犀牛人或金并）战斗，或瓦解各种帮派势力。

将黑蜘蛛侠的共生体战衣融入新游戏，是整个游戏的一大亮点。当蜘蛛侠身着经典的红蓝战衣时，他的行动速度更快，在普通民众中也更受欢迎。而当他穿上黑衣时，蜘蛛侠则会变身成一个更强大、更凶猛的自己。

该游戏还具有被称为“cineractives”的电影序列，玩家可以通过按下游戏手柄上的按钮或移动模拟摇杆来与动作进行互动。

莫比斯和史莱克都是可操作角色，在本作中担任Boss。在游戏进行到一定阶段后，这套黑色服装会变成可替换的配饰；但如果彼得长时间穿着它，就会有被制服的危险。